Va treballar en nombroses companyies de teatre d'afeccionats abans d'iniciar el seu treball com professional al teatre Romeade Barcelona, on de seguida va destacar pel seu extraordinari talent.
Molt aviat es va guanyar a la crítica barcelonina. La seva ductilitat com actriu li permetia adaptar-se a tots els gèneres, des del vodevil a la tragèdia La dama de les Camèlies, de Dumas, Maria Rosa, d'Àngel Guimerà o Salomé de Wilde.
El 1914 es va traslladar a Madrid. L'èxit en l'escena castellana li arriba de la mà de Pérez Galdós, del que va estrenar Marianela (1878). La seva època més brillant va ser quan va estar al capdavant de la companyia del Teatre Espanyol, on va representar els més destacats dramaturgs espanyols i estrangers,  interpretant obres de Valle Inclan, Bernard Shaw, d'Annunzio i Garcia Lorca.
Els seus muntatges dels clàssics del segle d'or van modernitzar l'escena espanyola, d'on va fer desaparèixer l'excés d'elements realistes. El seu instint dramàtic i el seu gust pel risc la van dur a apostar pels nous autors. Entre ells, destaca Federico García Lorca, del que va posar en escena Mariana Pineda, Yerma i DonyaRosita, la soltera. Ja mort  Lorca, Margarita Xirgu estrenarà La casa de Bernarda Alba a Buenos Aires.
La guerra civil espanyola la va sorprendre de gira per Amèrica. Exiliada voluntàriament a Amèrica del Sud, Margarita Xirgu va residir a Argentina i Uruguai, on va seguir representant l'obra d'autors espanyols com Lorca o Alberti. Obté el càrrec de directora de la Escuela Dramática Municipal de Montevideo i va contribuir a la formació de noves generacions d'actors iberoamericans des del seu lloc de directora.
Va obtenir la nacionalitat uruguaiana, va comprar una casa al balneari de Punta Ballena -al departament de Maldonado- i va romandre a l'Uruguai durant els seus últims vint anys de vida. El 1988, dinou anys després de la seva mort, la Generalitat demana la repatriació de les seves restes mortals, que actualment descansen a Catalunya, a Molins de Rei, el seu lloc de naixement.
L’Ajuntament de Molins de Rei atorga anualment el Premi Memorial Margarida Xirgu, creat per la Penya Teatral Carlos Lemos, a la millor actriu de la temporada teatral.